養殖知識  飼用乳酸菌的檢測方法圖文解釋
乳酸菌詳細檢測操作過程
1. 作為飼用乳酸菌的用戶,自己掌握乳酸菌的檢測方法,尤其有必要
    飼用微生物添加劑效果在很大程度上取決於其中是否含有乳酸菌,因為乳酸菌是飼用微生物添加劑中無可爭辯、當之無愧的主角菌;
    但實際上市場上的飼用微生物添加劑中極少含有乳酸菌,即便是廠家標示含有乳酸菌,也不要輕易相信,眼見為實,親自檢測一下是硬道理;
    乳酸菌在常溫下貯存時,極易死亡失活,夏天往往數天就全部死光,乳酸菌的生產技術複雜,培養難度高,包埋保護技術要求高,這幾個原因是造成市場上極少有乳酸菌的主要原因,總之,自己親自檢測驗證是必要的,不然,可能您使用了多年的飼用微生物添加劑中,基本上就只有芽孢桿菌或酵母菌,根本沒有乳酸菌,這種事非常多。
    而只有含有耐貯存,耐製粒的乳酸菌的飼用微生物添加劑,其效果就是絕非凡響!為什麼說乳酸菌才是飼用微生物添加劑中無可爭辯,當之無愧的主角,見網站相關文章的九條理由http://lac.hl99cn.com/show.asp?newsid=2070 。
    只有具備特殊的包埋保護的乳酸菌,才能在常溫下貯存和使用,好的乳酸菌製劑甚至可以耐受飼料製粒的要求,例如“強微牌”乳酸糞腸球菌就是耐貯存,耐制料的乳酸菌製品。
 
下面介紹乳酸菌的檢測方法——傾注法並產生透明圈的檢測方法的原理,和操作技術
    針對用戶大多數並不是微生物專業人員,編寫本文時,特意使用淺顯易懂的文字進行描述;
一. 本檢測方法的原理
1.1 檢測過程簡述
① 乳酸菌懸液的製備
    將待檢測的樣品,準確稱取0.5克,量取99.5mL無菌生理鹽水稀釋,(此次稀釋了200倍,即0.5克樣品,稀釋到了100克水溶液),再加入滅菌玻璃珠20~ 30粒,於250mL三角瓶中,置於振盪器或搖床上劇烈搖晃30分鐘以上,目的是將粘連在一起的乳酸菌細胞打散,分散開來。
② 稀釋到適當倍數
    根據所待檢測的樣品可能的乳酸菌含量,進行適當的稀釋操作,例如如果估計樣品的含乳酸菌活菌數為200億/克左右,則建議稀釋2億倍,這樣將來在90mm平板上培養時,會長出大約100個乳酸菌落,比較便於計數,總之,控制平板培養皿上的乳酸菌落數量在30~300個的範圍內,比較便於計數。
    我公司“強微”牌乳酸糞腸球菌系列產品,含乳酸菌活菌數的分析保證值均在100~300億/克範圍內(剛出廠的則在240–720億/克以上),所以,建議稀釋2–3億倍以上即可。
    稀釋方法用無菌生理鹽水,在250mL三角瓶中進行稀釋,方法見後述。
③ 倒制平板,即接種
    倒制平板在超淨工作台上進行,養殖戶可使用一盞簡單的酒精燈和一個乾淨的操作台就可操作;
    即事先配製好,並滅菌處理的檢測用瓊脂培養基,在水浴鍋內保持50℃的溫度,使瓊脂培養基呈溶解狀態,置於操作台旁邊備用;(養殖戶可先不從壓力鍋中取出,在壓力鍋維持一定的溫度,從而也不會凝固)
    取事先乾熱滅菌處理後的90mm培養皿(也叫平板)若干、1mL移液管若干,置於操作台上備用;(養殖戶的培養皿平板可在壓力鍋中進行蒸汽滅菌處理)
    在無菌條件下(打開超淨工作台無菌風,或養殖戶點上酒精燈),將稀釋了2億倍的乳酸菌液,用移液管移取1mL ,於培養皿中,再在此培養皿中倒入前述保持溶解狀態的檢測培養基液15mL左右(倒培養基時,估計能覆蓋滿平皿的液體量即可),然後,蓋好培養皿蓋,輕輕轉動平皿,原地轉幾圈,使培養基液與乳酸菌液混合均勻,等數分鐘後,待培養基凝固後,可移入培養箱中進行培養;
④ 培養箱中進行培養
將前面倒制好的平板,倒轉(即蓋子在下面),放於培養箱中,於33℃溫度下,培養2~3天,待培養皿平板中長出比較明顯的,帶有透明圈的菌落時,即可進行計數,得出檢測結果。
1.2 檢測的原理介紹
   本文介紹的乳酸菌檢測方法,是我公司用來檢測乳酸糞腸球菌的專利技術之一,檢測乳酸菌的培養基配方如下:
    用於檢測乳酸菌的培養基配方為:蛋白腖15g,牛肉膏5g,葡萄糖20g,氯化鈉5g,碳酸鈣10g,瓊脂粉10g,水1000ml,115~121℃滅菌20min,滅菌後放置水浴50 ℃保溫備用。
    可以看到,與普通的瓊脂培養基配方有兩個比較明顯的區別:
    ① 其中瓊脂的用量只有1%,比常規瓊脂培養基的2%用量少了一半,目的是降低瓊脂凝固溫度,為了在倒制平板時,使培養基能在較低的溫度下與熱敏性的乳酸菌混合,並一直呈溶解狀態,混合均勻後,才慢慢凝固;
    ② 同時,添加了1%的碳酸鈣,由於碳酸鈣難溶於水,所以,加入碳酸鈣後的瓊脂平板培養基為混濁狀態,為的是在將來培養乳酸菌時,乳酸菌在培養過程中產生乳酸,把菌落周圍的難溶性的碳酸鈣溶解,成為可溶性的乳酸鈣,並使菌落周圍的培養基變得透明,在菌落周圍產生透明圈,從而判斷其為乳酸菌。
 
二. 檢測儀器設備要求
2.1 正規的實驗室檢測乳酸菌需要如下儀器和設備:
    ① 恆溫培養箱;1000~2000元/台;
    ② 恆溫乾燥滅菌箱;1000~2000元/台;
    ③ 電子天平;200元/台左右;
    ④ 滅菌鍋;醫用的,或手提式高壓滅菌鍋;500元/台左右;
    ⑤ 玻璃儀器(滅菌的9cm培養皿,10mL、1mL的吸管,250mL三角瓶,玻璃珠一包等)
    ⑥ 顯微鏡;必要時觀察計數乳酸菌總數;檢測活菌幾乎不需要它。
    ⑦ 超淨工作台;用於接種操作;
    ⑧ 其他如橡皮筋,牛皮紙或報紙;
    ⑨ 記號筆
 
2.2 養殖戶或飼料廠簡單地檢測乳酸菌,需要的最簡單的儀器和設備
    ① 恆溫培養箱;1000~2000元/台;
    ② 酒精燈;代替正規實驗室的超淨工作台,在火焰上接種操作;
    ③ 天平;最簡單的小天平,數十元一台;
    ④ 壓力鍋;家庭蒸飯用的就行(但不是電飯煲);
    ⑤ 一個乾淨的操作檯面;
    ⑥ 玻璃儀器(滅菌的9cm培養皿,10mL、1mL的吸管各數根,250mL三角瓶10個以上,玻璃珠一包等),這幾樣加起來也就100多元;
    ⑦ 其他如橡皮筋,牛皮紙或報紙;
    ⑧ 記號筆
 
三. 藥品
    無論是正規實驗室,還是養殖戶或飼料廠非正規檢測,都需要以下藥品:蛋白腖,酵母膏,葡萄糖,氯化鈉,碳酸鈣。
 
四、針對正規實驗室的檢測方法
4. 檢測步驟(針對正規實驗室)
4.1 先準備乾熱滅菌的物品(針對正規實驗室)
    乾熱滅菌是指在恆溫乾燥滅菌箱中,以140℃以上的干熱空氣,對箱內物品進行消毒滅菌,主要用於玻璃儀器的滅菌處理。
    用報紙(最好有牛皮紙)和橡皮筋等包紮好如下物品:“培養皿、1mL移液管”;根據要檢測的樣品的數量,決定包紮的玻璃儀器的數量。包紮效果見圖示。
    以及準備好相應數量的250mL三角瓶,一個樣品需要至少4個三角瓶;
    將上述三角瓶,以及包紮好的培養皿,移液管等,放入恆溫乾燥滅菌箱中,於140℃以上滅菌3小時以上。備用。
 
4.2 再準備好濕熱滅菌的物品(針對正規實驗室)
    濕熱滅菌是指在滅菌鍋內,通過加熱產生飽和壓力水蒸汽,對物品進行滲透滅菌的過程,主要用於配製好的培養基滅菌,無菌水製作等的消毒處理。
① 平板(或叫培養皿)培養基的配製
    用於檢測乳酸菌的培養基配方為:蛋白腖15g,牛肉膏5g,葡萄糖20g,氯化鈉5g,碳酸鈣10g,瓊脂粉10g,水1000ml,溶解於250或500mL三角瓶中,再放入滅菌鍋內消毒滅菌處理,115~121℃滅菌20min,滅菌後放置水浴50℃保溫備用。
② 無菌生理鹽水的配製
    通常檢測一個樣品,需要用到至少400毫升無菌生理鹽水,據此,計算您的需要量,配製好後,進行滅菌處理。
    生理鹽水含氯化鈉0.85%,即稱取0.85克氯化鈉,溶解於100毫升水中即可,然後,放於滅菌鍋內滅菌處理。備用。
 
4.3 樣品的製備(針對正規實驗室)
4.3.1 乳酸菌懸液的製備
    將待檢測的樣品,準確稱取0.5克,量取99.5mL無菌生理鹽水稀釋,(此次稀釋200倍),再加入滅菌玻璃珠20~30粒,於250mL滅菌三角瓶中,在搖床上於180rpm轉速下,搖晃30分鐘以上,目的是將粘連在一起的乳酸菌細胞打散,分散開來。
4.3.2 用生理鹽水稀釋到2億倍
    用1mL的移液管,移取1mL 上述菌懸液,移入250mL滅菌三角瓶中,再加入99mL無菌生理鹽水,搖晃均勻,即此次操作稀釋了100倍,前述乳酸菌懸液的製備時,已稀釋了200倍,則一共稀釋了2×104倍;
   再用新的移液管和新的250mL滅菌三角瓶,取上述稀釋液,再重複上述操作,再稀釋100倍,則稀釋了2×106倍;
   再用新的移液管和新的250mL滅菌三角瓶,取上述稀釋液,再重複上述操作,再稀釋100倍,則稀釋了2×108倍;即2億倍。
 
4.4 倒制平板,即接種(針對正規實驗室)
    倒制平板在超淨工作台上進行,以保持無菌環境中操作;
    把事先配製好,並滅菌處理後的檢測用培養基,在水浴鍋內保持50℃的溫度,置於操作台旁邊備用;
    取事先乾熱滅菌處理後的90mm培養皿(也叫平板)若干、1mL移液管若干,置於操作台上備用;
    在無菌條件下(打開超淨工作台無菌風),將稀釋了2億倍的乳酸菌液,用移液管移取1mL ,於培養皿中,再在此培養皿中倒入前述保持溶解狀態的檢測培養基液15mL左右(倒培養基時,估計能覆蓋滿平皿的液體量即可),然後,蓋好培養皿蓋,輕輕轉動平皿,原地轉幾圈,使培養基液與乳酸菌液混合均勻,等數分鐘後,待培養基凝固後,可移入培養箱中進行培養;

4.5 培養箱中進行培養
    將前面倒制好的平板,放於培養箱中,於33℃溫度下,培養2~3天,待培養皿平板中長出比較明顯的,帶有透明圈的菌落時,即可進行計數,得出檢測結果。
 
4.6 計數
    從培養箱中取出培養好的平板,用記號筆為計數工具,在平板的背面進行計數,如室內光線不好,必要時,將培養皿對著燈光進行計數;
    在培養好的平板上,凡是帶有透明圈的菌落,才算是乳酸菌菌落,不然,就不是乳酸菌,我們計數,也就是計算這些帶有透明圈的菌落數。
    每計數一個菌落,就用記號筆在平板背面相應位置點一下,留下一個記號痕跡,一直將平板上所有的帶有透明圈的菌落全部數完為止。
    記錄計數值。
 
4.7. 結果計算
    計算公式:
    樣品中含活的乳酸菌數量(億個/克,或億cfu/g)= 計數值×2
 
五、針對養殖戶或中小飼料廠的簡單檢測方法
5. 檢測步驟(針對養殖戶或中小飼料廠)
    養殖戶或中小飼料廠,如果沒有乾燥滅菌箱,可以將全部需要滅菌消毒的物品,都用濕熱滅菌法消毒,即都使用蒸飯用的壓力鍋消毒即可。
    注意:壓力鍋消毒時,要事先在壓力鍋內墊上一個鋁墊片,支起一個內膽,在內膽中放置待消毒物品,墊片處放清水作為蒸汽發生用水,具體見圖未:
    濕熱滅菌是指在壓力鍋內,通過加熱產生飽和壓力水蒸汽,對物品進行滲透滅菌的過程。
 
5.1 再準備好壓力鍋中需要滅菌的物品(針對養殖戶或中小飼料廠)
① 平板(或叫培養皿)培養基的配製
    用於檢測乳酸菌的培養基配方為:蛋白腖15g,牛肉膏5g,葡萄糖20g,氯化鈉5g,碳酸鈣10g,瓊脂粉10g,水1000ml,溶解於250或500mL三角瓶中,再放入壓力鍋內消毒滅菌處理,上汽後保持滅菌25min,滅菌後備用。
    因為倒制平板時,需要溶解狀態的培養基,而養殖戶往往沒有水浴鍋來保持培養基的溫度達到45~50℃,這是個問題,建議養殖戶,在最後來操作這一步,即所有其他的東西都準備好後,最後來滅菌平板培養基,待它冷卻到手感微燙時,直接用來倒制平板。
② 無菌生理鹽水的配製
    通常檢測一個樣品,需要用到至少400毫升無菌生理鹽水,據此,計算您的需要量,配製好後,進行滅菌處理。
    生理鹽水含氯化鈉0.85%,即稱取0.85克氯化鈉,溶解於100毫升水中即可,然後,放入壓力鍋內消毒滅菌處理,上汽後保持滅菌25min,滅菌後備用。
③ 其他需要壓力鍋滅菌處理的物品
    用報紙(最好有牛皮紙)和橡皮筋等包紮好如下物品:“培養皿、1mL移液管”;根據要檢測的樣品的數量,決定包紮的玻璃儀器的數量。包紮效果見圖示。
    以及準備好相應數量的250mL三角瓶,一個樣品至少需要4個三角瓶;
    將上述三角瓶,以及包紮好的培養皿,移液管等,放入壓力鍋內消毒滅菌處理,上汽後保持滅菌25min,滅菌後備用。
 
5.2 樣品的製備(針對正規實驗室)
5.2.1 乳酸菌懸液的製備
    將待檢測的樣品,準確稱取0.5克,量取99.5mL無菌生理鹽水稀釋,(此次稀釋200倍),再加入滅菌玻璃珠20~30粒,於250mL滅菌三角瓶中,養殖戶沒有搖床,只能辛苦點,用手握好三角瓶,用力搖晃30分鐘以上,目的是將粘連在一起的乳酸菌細胞打散,分散開來。
5.2.2 用生理鹽水稀釋到2億倍
    用1mL的移液管,移取1mL 上述菌懸液,移入250mL滅菌三角瓶中,再加入99mL無菌生理鹽水,搖晃均勻,即此次操作稀釋了100倍,前述乳酸菌懸液的製備時,已稀釋了200倍,則一共稀釋了2×104倍;
   再用新的移液管和新的250mL滅菌三角瓶,取上述稀釋液,再重複上述操作,再稀釋100倍,則稀釋了2×106倍;
   再用新的移液管和新的250mL滅菌三角瓶,取上述稀釋液,再重複上述操作,再稀釋100倍,則稀釋了2×108倍;即2億倍。
 
5.3 倒制平板,即接種(針對正規實驗室)
    養殖戶沒有超淨工作台,倒制平板在酒精燈的火焰旁邊進行,但必須有一個比較乾淨的操作台,如瓷板操作檯面上操作,以保持無菌環境中操作;
5.3.1 保持平板培養基的溶解狀態
    因為倒制平板時,需要溶解狀態的培養基,而養殖戶往往沒有水浴鍋來保持培養基的溫度達到45~50℃,這是個問題,建議養殖戶,在最後來操作這一步,即所有其他的東西都準備好後,最後來滅菌平板培養基,待它冷卻到手感微燙時,直接用來倒制平板。
5.3.2 倒平板操作
    取事先乾熱滅菌處理後的90mm培養皿(也叫平板)若干、1mL移液管若干,置於操作台上備用;
    在無菌條件下(點上酒精燈,盡量在避風處,空氣乾燥清爽的環境中,以及比較乾淨的瓷板操作平台上操作),將稀釋了2億倍的乳酸菌液,用移液管移取1mL ,於培養皿中,再在此培養皿中倒入前述保持溶解狀態的檢測培養基液15mL左右(倒培養基時,估計能覆蓋滿平皿的液體量即可),然後,蓋好培養皿蓋,輕輕轉動平皿,原地轉幾圈,使培養基液與乳酸菌液混合均勻,等數分鐘後,待培養基凝固後,可移入培養箱中進行培養;
    注意以上操作,盡量在酒精燈的火焰旁邊操作。
    待平板中的培養基,冷卻凝固後,移入培養箱中進行培養。
 
 5.4 進行培養
    將前面倒制好的平板,放於培養箱中,於33℃溫度下,培養2~3天,待培養皿平板中長出比較明顯的,帶有透明圈的菌落時,即可進行計數,得出檢測結果。
    如果養殖戶沒有培養箱,也可以在仔豬或雛雞保溫箱中進行培養,熱源採用紅外燈熱源,但注意要使用乾淨的箱子或容器來培養。
 
5.5 計數
    從培養箱中取出培養好的平板,用記號筆為計數工具,在平板的背面進行計數,如室內光線不好,必要時,將培養皿對著燈光進行計數;
    在培養好的平板上,凡是帶有透明圈的菌落,才算是乳酸菌菌落,不然,就不是乳酸菌,我們計數,也就是計算這些帶有透明圈的菌落數。
    每計數一個菌落,就用記號筆在平板背面相應位置點一下,留下一個記號痕跡,一直將平板上所有的帶有透明圈的菌落全部數完為止。
    記錄計數值。
 
5.6. 結果計算
    計算公式:
    樣品中含活的乳酸菌數量(億個/克,或億cfu/g)= 計數值×2